【實驗目的】

掌握變性梯度凝膠電泳檢測新的突變，以及測定高度多態基因的基因型的技術方法。

【實驗原理】

在現代遺傳學中DNA 序列突變的分析占有十分重要的地位。由于在較大DNA 序列中檢測一個細微的突變非常困難，因而現在人們建立了幾種方法來解決這一難題。變性梯度凝膠電泳(DGGE)能把長度相同而核苷酸順序不同的雙鏈DNA 片段分開。這種方法利用了DNA 分子從雙螺旋型變成局部變性型時電泳遷移率會下降的現象。不同的DNA 片段發生這種變化所需梯度不同。DGGE 的凝膠中沿電場方向變性劑(甲醛和尿素)含量遞增，當DNA 片段通過這種變性劑遞增的凝膠時，不同分子的電泳遷移率在不同區域會發生降低。這就可使核苷酸順序不同DNA 片段分開。此方法可作為測序的初始步驟在雜合個體中分離等位基因。許多研究表明變性遞度凝膠電泳分離能力很強，它可以把相差僅1bp 的DNA 片段分開。

【儀器、材料與試劑】

1.50×TAE 緩沖液(2mol/LTris 乙酸鹽，0.05mol/L EDTA pH8.0)1L 體積：242gTris堿，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。

2.丙烯酰胺貯存液：40%丙烯酰胺(38:2 丙烯酰胺:雙丙烯酰胺)。

3.過硫酸銨貯存液(10%)：10mL 配制：1g 過硫酸銨加水至10mL。TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。

4.變性劑貯存液：(0%)6%丙烯酰胺TAE 溶液。250mL 溶液：37.5mL 丙烯酰胺貯存液，5mL50×TAE 緩沖液，加水至250mL，過濾和排氣。

5.變性劑貯存液(100%)：6%丙烯酰胺，7mol/L 尿素，40%甲醛TAE 溶液。250mL配制：37.5mL 丙烯酰胺貯存液，5mL50×TAE 緩沖液，105g 尿素，100mL 甲醛，加水至750mL，過濾并排氣。

6.染料：40%(W/V)蔗糖，0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青和30%甘油。

7.塑料膠框、梳子和墊片，兩個用于固定膠框中玻璃片的塑料支架。

8.一有柄和一無柄的兩片玻璃板(尺寸：17.78cm 寬×20.32cm 長×0.635cm 厚)，有柄的玻璃板有一個13.97cm 寬，2.54cm 厚的突出。

9.無金屬結構的塑料槽(尺寸：43.18cm 長×22.86cm 寬×22.86cm 深；可以允許一塊或兩塊膠同時電泳)。

10.電源、陽極—鉑制；陰極—石墨棒(直徑0.635cm)。

11.蠕動泵及連接管、攪拌器和加熱器、梯度生成器：每側容積15～25mL。

【實驗步驟】

1.制備平行膠：平行膠中從上至下變性劑的濃度遞增。這種膠適用于分析大量樣品。

1)與制備標準聚丙烯胺凝膠一樣制備膠板。

2)從丙烯酰胺和兩種變性劑貯存液中取兩份等體積溶液以符合要求的變性劑濃度范圍。溶液的總體積一般為剛好覆蓋膠板。丙烯酰胺的濃度取決于DNA 片段的大小，對于DNA 片段大小為≥300bp 的丙烯酰胺的濃度為6%，而長度＜300bp 的DNA 片段，丙烯酰胺的濃度為12%。

3)加高濃度變性劑溶液到梯度生成器右槽中(該溶液將首先通過梯度合成器進入膠板間的空隙)，打開連接梯度生成器兩端的開關，讓一些溶液流入左槽內關上開關，用吸管把它們移回到右槽(目的是確保兩槽之間無氣泡的阻隔)。然后把低濃度變性劑溶液加到梯度生成器左槽中。

4)攪拌這兩個槽中溶液的同時向其中加入4.5μL/mLl0%的過硫酸銨和1μL/mL 的TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。

5)輕輕打開兩槽之間的開關及梯度生成器出口的開關，灌膠時兩槽內的溶液應處于攪拌狀態(尤其高濃度溶液槽更應攪拌)，溶液受重力影響通過一個放在兩塊玻璃板之間的頂部的細塑料管流過梯度生成器。流速應保持一定大小以保證溶液在凝聚之前所有溶液都應注入到兩層玻璃板之間。(凝聚速度可通過調整過硫酸銨和TEMED 的濃度來調節)

6)膠板充滿后，在其頂部插入梳子并將其放平，凝聚至少30min。(膠可事先灌好并于4℃貯存幾天)。

2.制備垂直膠：垂直膠含有丙烯酰胺的濃度是固定的，垂直于電泳方向有一個線性遞增的變性劑梯度。這種膠適用于確定分離含有核苷酸改變的DNA 片段的最佳梯度范圍。垂直膠的制備大體相似和平行膠的制備，但也有所不同：

1)像標準的聚丙烯酰胺凝膠一樣制備膠板，但其頂部不插入梳子。

2)準備一塊比梳子稍短的涂上潤滑劑的間隔片插在梳子的位置，位置稍突出一些，這樣左邊就留下一個缺口。用夾子夾緊這一邊。把膠板旋轉90°這樣和缺口相連的這一面就轉到最上面了。膠液將通過該缺口進入兩玻璃板之間。如前所述的方法灌膠。

3)膠完全凝固之后，將膠板垂直立起，輕輕移出膠頂部的間隔片。膠的頂部就會出現大而平的孔，這樣就可以進行電泳了。

3.DNA 電泳：(平行或垂直DGGE 的步驟是相同的)

1)移去頂部間隔片或梳子之后，將相關設備和膠移至含有加熱到60℃的緩沖液的電泳槽內，使緩沖液高度剛剛沒過膠上的加樣孔。

2)連上蠕動泵以使緩沖液能從槽內流至頂部槽內(陰極)。之后緩沖液漫過框架邊緣的小孔重新流回槽內(頂槽緩沖液循環是必須的，目的是避免電泳過程中pH 值的顯著增加和離子強度的改變)。

3)對垂直膠電泳來說，向膠頂部的加樣孔中加入100μL PCR 產品(其中包括20μL的上樣染料)；而對于平行膠電泳來說，每個加樣孔中加入15～20μL 樣品。

4)按照凝膠寬度在頂槽內放置石墨電極，并根據片段的大小在150～350V 電壓下電泳3～15h。在平行膠上，250V、電泳5h 可使300bp 的片段移到凝膠的1/3 處。

5)0.5μg/mL 溴化乙錠中進行染色并觀察。

【注意事項】

1.在混合和灌膠時應避免產生氣泡。

2.有時聚丙烯酰胺凝膠的左側會出現縮水現象以致在膠的頂部到底部之間會產生空氣通道，可用2%熔化的瓊脂糖凝膠將其充滿。

3.所有溶液應保存于4℃棕色瓶中，一般幾個月到一年內有效。

4.電泳時凝膠溫度必須保持恒定，要達到這一要求，可把膠板浸沒于充分攪拌的溫控緩沖液槽內。對于缺乏變性劑時比較容易變性的DNA 來說，槽內的溫度選擇在60℃稍微超過熔點，并且大部分的工作都在60℃下進行(但溫度稍高或低一點都可采用)。溫度保持恒定可將電泳緩沖液加熱到60℃，并把膠浸入其中進行電泳即可。